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ELISA預(yù)實驗完整攻略

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ELISA預(yù)實驗完整攻略


ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)預(yù)實驗是開展正式實驗前必不可少的環(huán)節(jié),主要用于摸索合適的實驗條件及確定實驗的可行性。以下是ELISA預(yù)實驗的開展過程,一起來看看吧!

一、預(yù)實驗的目的
確定實驗條件:如抗原或抗體的濃度、酶的種類和濃度、洗滌液的濃度和pH值等,以確保實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。
確定實驗范圍:包括最佳反應(yīng)時間和濃度范圍,以確保在正式實驗中獲得最佳的實驗結(jié)果。
驗證實驗方法:確保實驗方法的準(zhǔn)確性和可靠性。
減少實驗誤差:提高實驗的重復(fù)性和可重復(fù)性。

二、預(yù)實驗的方法

1.實驗樣本的選擇:
預(yù)實驗一般通過測定少數(shù)有代表性的樣本來確定正式實驗方案。通常,測定的樣本會分為不同的組別,不同組別的樣本由于前期處理或刺激后,靶標(biāo)物的表達量會產(chǎn)生變化。建議從各組樣本中隨機選擇1~2例樣本。如果正式實驗測定的樣本數(shù)量多,分配到預(yù)實驗的試劑量有限,那么至少選擇兩例樣品,建議選用1例為理論上靶標(biāo)物含量最低組的樣品,另1例為理論上靶標(biāo)物含量最高組的樣品。

2.最適稀釋倍數(shù)的確定:
①將樣本梯度稀釋,可根據(jù)樣本中靶標(biāo)物的濃度,選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋,同時測定標(biāo)準(zhǔn)品。
②標(biāo)準(zhǔn)品的制備需按照試劑盒說明書的要求,試劑量充足可以選擇一條完整的標(biāo)曲,試劑量有限也可以選擇部分濃度點(如空白孔、最低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔)。
③將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的OD值(光密度值)與梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值進行對比,最佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部或絕大多數(shù)樣本OD值能夠位于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度孔對應(yīng)的OD值,即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳擬合區(qū)域。
④在做預(yù)實驗時,一定要設(shè)置標(biāo)曲,不設(shè)置標(biāo)曲則無法通過比較確定最適稀釋倍數(shù)。

3.抗原包被濃度的設(shè)定:
①將抗原溶液分別按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的濃度稀釋在抗原包被液中。
②以等量隨機選取的特異性抗體血清與抗原溶液反應(yīng),在37℃孵育1小時后清洗,然后加酶標(biāo)二抗,孵育30分鐘清洗,最后加底物顯色,反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔的光密度值。
③繪制ROC曲線(受試者工作特征曲線),找出臨界值。

4.酶標(biāo)二抗稀釋比例的確定:
①取已知陽性和陰性血清樣本,分別用ELISA稀釋液將特異性抗體稀釋成不同濃度的酶標(biāo)二抗溶液,與包被抗原孵育、清洗后加底物顯色,最后用酶標(biāo)儀測定光密度值。
②繪制ROC曲線,找出臨界值。

5.顯色時間的確定:
①顯色是ELISA實驗中最后一步溫育反應(yīng),固定在酶標(biāo)板上的酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。
②由于ELISA實驗會受到環(huán)境差異及實驗操作差異的影響,商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間,而是建議實驗操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應(yīng)時間。
③加入底物后可定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(如每隔5分鐘觀察一次),當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3~4孔有明顯的梯度藍色,后3~4孔梯度不明顯時,即可終止。通過預(yù)實驗熟悉操作的同時,也能確定合適的顯色時間。

三、注意事項
①在進行預(yù)實驗時,應(yīng)嚴格按照ELISA試劑盒的說明書進行操作,避免由于操作不當(dāng)導(dǎo)致的實驗誤差。
②預(yù)實驗的結(jié)果應(yīng)認真記錄和分析,以便為正式實驗提供可靠的依據(jù)。
③在預(yù)實驗過程中,如發(fā)現(xiàn)任何異常或不符合預(yù)期的結(jié)果,應(yīng)及時查找原因并進行調(diào)整。

通過以上預(yù)實驗的設(shè)置和操作,可以對ELISA實驗的條件進行初步的摸索和優(yōu)化,為后續(xù)的正式實驗提供可靠的基礎(chǔ)。同時,也能及時發(fā)現(xiàn)實驗中存在的問題,進行針對性的改進,提高實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。上海恒遠生物專業(yè)提供生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)服務(wù),提供全方位實驗技術(shù)服務(wù),為廣大科研工作者大大節(jié)省了重復(fù)勞動的時間和精力,我們有過硬的技術(shù)咨詢和完善的售后服務(wù),購買ELISA試劑盒贈送免費代測服務(wù),在線一對一技術(shù)指導(dǎo),為您解決后顧之憂。

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